Apoptose und Nekrose in den zirkumventrikulären Organen nach experimenteller Subarachnoidalblutung, nachgewiesen mit Annexin V und Caspase 3-Immunfärbung
Ziele: Die zirkumventrikulären Organe (CVOs) sind für die meisten autonomen und endokrinen Funktionen essentiell. Traumata und Blutungen können ihre Funktion beeinträchtigen. Das Ziel dieser Studie war es, Apoptose und Nekrose in CVOs in der frühen Phase nach einer experimentellen Subarachnoidalblutung (SAH) bei Ratten mithilfe von Annexin-V-Affinität und Caspase-3-Immunfärbung zu untersuchen.
Methoden:Es wurden drei Versuchsgruppen verwendet: Tage 1 und 2 nach SAH und eine Kontrollgruppe, jeweils sieben Wistar-Albino-Ratten. Die Subarachnoidalblutung wurde durch eine transclivale Punktion der Basilararterie erreicht. Die Ratten wurden bis zum Herzstillstand mit 0,9 % NaCl und 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,4, perfundiert. Apoptose und Nekrose in CVOs wurden durch Durchflusszytometrie mit Annexin-V-Färbung und durch Caspase-3-Immunfärbung gemessen.
Ergebnisse: Apoptose im Organum vasculosum lamina terminalis (OVLT) , die mittlere Eminenz (ME) und die Area Postrema (AP) waren in der Tag-1-Gruppe signifikant höher als in der Kontrollgruppe. Die Apoptose im subfornizialen Organ (SFO), OVLT, ME und AP war in der Tag-2-Gruppe signifikant höher als in der Kontrollgruppe. Mit Ausnahme von AP gab es signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen von Tag 1 und Tag 2. Die Nekrose bei SFO und OVLT war in der Tag-2-Gruppe signifikant höher als in der Tag-1- oder Kontrollgruppe, wohingegen sich die Nekrose in ME und AP zwischen den drei Gruppen nicht unterschied . Die Caspase-3-positive Zelldichte war in der Tag-2-Gruppe intensiver als in der Tag-1-Gruppe und den Kontrollgruppen.
Diskussion: Die Prävention von Apoptose kann möglicherweise beeinträchtigte Funktionen von CVOs danach verbessern SAH.
Einleitung
Apoptose ist der programmierte Zelltod, der bei pathologischen Zuständen wie einer Subarachnoidalblutung (SAH) verändert wird .1 Es wird angenommen, dass Apoptose ein Faktor ist, der zur Pathogenese von frühen Hirnverletzungen,2 Vasospasmen3 und Hirninfarkten4, die nach SAB beobachtet werden, beiträgt. In der Literatur gibt es Berichte über Apoptose1,2,5,6 und Nekrose7,8 nach SAB und deren Verbesserungen nach Verabreichung von Apoptosehemmern.5,6 Studien haben dies gezeigt d, dass die Hemmung der apoptotischen Wege nach SAH nicht nur den Zelltod reduzierte
, sondern auch zu einer signifikanten Verbesserung des funktionellen Ergebnisses führte2,4 und somit möglicherweise viele der damit verbundenen Sekundärschäden unterdrückte SAH.1
Neben vielen wertvollen Zentren des Gehirns auch eine Reihe sensorischer zirkumventrikulärer Organe (CVOs), wie zum Beispiel das Subfornizialorgan (SFO) , Organum vasculosum lamina terminalis (OVLT), Area postrema (AP) und die mittlere Eminenz (ME, ein sekretorisches CVO) werden durch SAH beeinflusst /strong> strong>9,10 Zirkumventrikuläre Organe sind reich an Neurotransmittern und haben keine Blut-Hirn-Schranke.11,12
Annexin V hat nachweislich eine starke Wechselwirkung speziell mit Phosphatidylserin und kann daher zum Nachweis früher Apoptose verwendet werden.15 Die Caspase-3-Immunfärbung ist eine weitere Methode, die derzeit zum Nachweis von Apoptose in Gewebeproben verwendet wird.16
In dieser Studie haben wir das Vorhandensein von früher und später Apoptose untersucht Apoptose/Nekrose durch Annexin-V-Affinität und Caspase-3-Immunfärbung in CVOs nach experimenteller SAH bei Ratten. Bei unserer Durchsicht der Literatur konnten wir keinen früheren Bericht zu diesem Thema finden.
Materialien und Methoden
Das Studienprotokoll wurde von Bu genehmigt ¨lent Ecevit University Tierethikkommission.
Die Experimente wurden im Labor für experimentelle Chirurgie, Forschung und Tiere der Bülent Ecevit University, Fakultät für Medizin, Zonguldak, Türkei, durchgeführt. Insgesamt wurden 21 männliche erwachsene Wistar-Albino-Ratten mit einem Gewicht von 200–300 g in die Studie einbezogen. Alle Ratten wurden bei 22–25 °C und angemessener Luftfeuchtigkeit in einem 12/12-Stunden-Hell/Dunkel-Zyklus gehalten und erhielten Flüssigkeit und Futter nach Belieben. Die Ratten wurden wie folgt in drei Gruppen eingeteilt: Tag 1 nach SAH (n 5 7), Tag 2 nach SAH (n 5 7) und Kontrollen (n 5 7).
Ratten wurden durch intraperitoneale Injektion von Ketamin (60 mg/kg) und Xylazin (10 mg/kg) betäubt. Die experimentelle SAH wurde mit einer Technik durchgeführt, die der von Barry et al.17 beschriebenen Technik ähnelte und bereits zuvor beschrieben wurde.9,10
Kurz gesagt wurde in Rückenlage unter einer Operation ein Schnitt in der Mittellinie des Gebärmutterhalses vorgenommen Mikroskop (Takagi OM-5, Japan) und der Clivus wurde über den anterioren parapharyngealen Zugang freigelegt. Ein knochiger Windo w vor der Basilararterie wurde mit großkalibrigen Nadeln erstellt, wobei äußerst darauf geachtet wurde, die präpontine Zisterne nicht zu öffnen. Eine Nahtnadel mit einem Außendurchmesser von 75 mm (Ethicon, Livingston, UK) wurde in die Basilararterie eingeführt. Das Zurückziehen der Nadel verursachte eine ausgedehnte Blutung in den Subarachnoidalraum mit gleichmäßiger Verteilung bis in den Riechbereich. Die Ratten wurden nach der SAH unter geeigneten Bedingungen 1 und 2 Tage lang am Leben gehalten.
Die Ratten wurden durch Perfusion eingeschläfert. Unter Narkose wurde eine Thorakotomie durchgeführt, dann wurde der linke Ventrikel kanüliert, die absteigende Aorta abgeklemmt, der rechte Vorhof eingeschnitten und das Blut aus dem Kopf- und Halsbereich mit 0,9 % NaCl und 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,4) gewaschen. bis das Herz stehen blieb. Die Tiere wurden enthauptet und Proben von SFO, OVLT, ME und AP wurden unter Verwendung eines stereotaktischen Rattenatlas (Paxinos & Watson)
Das Prinzip der Annexin-V-Methode gewonnen . dient dazu, mittels Durchflusszytometrie die Affinität von Annexin V zu Phosphatidylserin zu messen, das während der Apoptose von der inneren Plasmamembran zur äußeren Membran verlagert wird.15 Zellen wurden aus den verschiedenen CVO geerntet. starke >s separat. Für jede Probe verwendeten wir 100 ml Zellsuspension. Annexin V, konjugiert mit Fluoresceinisothiocyanat (FITC), färbte apoptotische Zellen in Gegenwart von Propidiumiodid (PI). Diese Reaktion ermöglicht den Nachweis von Phosphatidylserin auf der Oberfläche apoptotischer Zellen. Sowohl PI-positive als auch Annexin V-positive Zellen zeigten einen prozentualen nekrotischen Status an. Wir verwendeten ein kommerzielles Annexin-FITC-Kit (Beckman-Coulter, Fullerton, CA, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers und einen Coulter FC500 > > Durchflusszytometer (Beckman-Coulter). Eine schematische Darstellung des Verlusts der Membranlipidasymmetrie während der frühen Apoptose und der Annexin V-spezifischen Bindung an Phosphatidylserin ist in Abb. dargestellt. 1. PI-positive und Annexin V-positive Zellen weisen auf eine späte Apoptose oder Nekrose hin (Abb. 1).
Für histopathologische und immunhistochemische Analysen CVOs Für alle Gruppen wurden Rattengehirne verwendet. Proben zirkumventrikulärer Organe jeder Ratte wurden in 10 % neutraler Formalinlösung fixiert und dann in Paraffinwachs eingebettet. Die Schnitte wurden auf einem Kryostaten bei 5–6 mm geschnitten Dicke Anschließend wurden die Gewebeschnitte entparaffiniert und zur histomorphologischen Analyse mit Hämatoxylin und Eosin (H&E) sowie Kresylviolett gefärbt. Zirkumventrikuläre Organe wurden unter dem Lichtmikroskop von einem einzigen Pathologen (FB) untersucht, der für die Studiengruppen blind war. Eine immunhistochemische Analyse unter Verwendung des polyklonalen Antikörpers Anticaspase 3 (CPP32) (Neomarkers, Cat #RB-1197R7, Fremont, CA, USA) wurde ebenfalls durchgeführt, um die Apoptose zu bewerten. Die Immunfärbung basierte auf der Streptavidin-Biotin-Peroxidase-Komplex-Technik mit Mikrowellen-Antigengewinnung unter Verwendung von in Formalin fixierten, in Paraffinwachs eingebetteten Geweben. In Wachs eingebettete Schnitte wurden auf Objektträgern gesammelt und anschließend entparaffiniert und rehydriert. Nach dem Entparaffinieren wurden die Schnitte mit 10% Wasserstoffperoxidase in gefiltertem Wasser behandelt, um die endogene Peroxidaseaktivität zu blockieren. Zur Antigengewinnung wurden die Objektträger mit 10 mmol/L Citratpuffer (pH 7) 10 Minuten lang in der Mikrowelle gekocht. Die Objektträger wurden dann mit primären Antiseren inkubiert, einschließlich des polyklonalen Caspase-3-Kaninchen-Antikörpers (Neomarkers, Cat #RB1197-R7, Fremont, CA, USA). Nach dem Waschen in phosphatgepufferter Kochsalzlösung wurden die Gewebe auf den Objektträgern mit einem Biotin-konjugierten Sekundärantikörper inkubiert, gefolgt von einer 30-minütigen Inkubation in den Komponenten des Streptavidin-Biotin-Systems bei Raumtemperatur. Die Reaktionen wurden nach Eintauchen der Proben in 3,39-Diaminobenzidintetrahydrochlorid (DAB; Lab Vision, Fremont, CA, USA) sichtbar. Anschließend wurden die Schnitte mit Hämatoxylin gegengefärbt, dann gespült und montiert. Bei der Negativkontrolle wurde der primäre Antikörper weggelassen und als Positivkontrolle wurde Mandelgewebe verwendet. Caspase 3-Immunreaktivität wurde überwiegend im Zytoplasma mit etwas Kernfärbung beobachtet. Die Objektträger wurden blind von einem einzelnen Pathologen (FB) ausgewertet. Die Apoptose, gemessen anhand der Caspase-3-positiven Zelldichte, wurde in den CVOs für jede Gruppe bewertet.
Statistische Analyse
Das statistische Paket für Sozialwissenschaften (Version 19.0; SPSS Inc, Chicago, IL, USA) wurde für alle Datenanalysen verwendet. Die Ergebnisse wurden als Median und Bereich ausgedrückt. Der Shapiro-Wilk-Test wurde für den Normalitätstest für Variablen ohne Normalverteilung verwendet, und der Kruskal-Wallis-Test wurde für Vergleiche zwischen den drei Gruppen verwendet. Der Conover-Test war Wird für Post-hoc-Vergleiche verwendet. Für alle statistischen Vergleiche wurde 0,05 statistisch berücksichtigt.
Ergebnisse
Durchflusszytometrische Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengefasst. Grafiken stammen aus PI/Annexin Significant V Die durchflusszytometrische Analyse der SFO, OVLT, ME und AP (Kontroll- und Tag-2-Gruppen) ist in Abb. dargestellt. 2. In der Tag-1-Gruppe waren die Ergebnisse der frühen Apoptose, dargestellt als Median (Bereich), wie folgt: OVLT 0,50 % (0,08–1,89), ME 0,55 % (0,21–0,84) und AP 0,46 % (0,20–1,86), Apoptose imSFO unterschied sich nicht wesentlich von der Kontrollgruppe. Für die Tag-2-Gruppe war die frühe Apoptose wie folgt: SFO 1,88 % (0,97–2,99), OVLT 1,85 % (0,77–3,16), ME 0,79 % (0,54–1,43) und AP 0,82 % (0,19–1,49). ). ), die in allen vier Bereichen deutlich höher war als in der Kontrollgruppe. In der Kontrollgruppe betrug die frühe Apoptose 0,12 % (0,02–0,35) in der SFO, 0,15 % (0,04–0,71)in der OVLT, 0,18 % (0,09–0,34) > imME, und 0,06 % (0,01–0,24) im AP.
Nekrose im SFO und OVLT in der Tag-2-Gruppe waren signifikant höher als sowohl in der Tag-1- als auch in der Kontrollgruppe, und die Ergebnisse für ME und AP unterschied sich nicht zwischen der Gruppe am Tag 1 und der Kontrollgruppe
Die histopathologische Untersuchung der Abschnitte SFO, OVLT, ME und AP zeigte einen deutlicheren Zellverlust in der Gruppe am Tag 2 als in die anderen Gruppen.
Die Caspase-3-positive Zelldichte war in der Tag-2-Gruppe intensiver als in den anderen beiden Gruppen. In der Kontrollgruppe gab es nur wenige Caspase-3-positive Zellen, und die Gruppe am Tag 1 hatte weniger Caspase-3-positive Zellen als die Gruppe am Tag 2.
Diskussion
Apoptose ist einer der Mechanismen in der Entwicklung des Zelltods, der nach klinischer und experimenteller SAH beobachtet werden kann.
In dieser Studie vonCVOsSAH bei Ratten wurde Apoptose in SFO, OVLT, AP und ME beobachtet. In der Studiengruppe am ersten Tag fanden wir eine erhöhte Annexin-V-Affinität zu Phosphatidylserin (frühe Apoptose) in allen CVOs mit Ausnahme des SFO. Am Tag 2 g
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